原代細胞培養(yǎng)的幾種常見技術(shù)

原代細胞傳代技術(shù)

一、貼壁細胞的消化法傳代
1、吸除或倒掉瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。
2、加入1ml左右消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使瓶底細胞都浸入溶液中。
3、消化2-5分鐘后把培養(yǎng)瓶放置在顯微鏡下進行觀察，發(fā)現(xiàn)原貼壁的細胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時，棄去消化液，加入培養(yǎng)液終止消化。
4、用吸管將貼壁的細胞吹打成懸液，分別接種到另外兩到三個培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長情況。

二、懸浮細胞的傳代
1、直接傳代 
① 讓懸浮細胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清吸掉1/2-2/3。
② 用吸管吹打形成細胞懸液后，分別接種到另外兩到三個培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2、離心法傳代
 ① 將細胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，離心800-1000rpm，5分鐘。
② 去除上清，加新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi)，用吸管吹打使之形成細胞懸液。
③ 將細胞懸液分別接種到另外兩到三個培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

原代細胞凍存技術(shù)

1、選用生長情況好，數(shù)量較多的原代細胞，凍存前一天換液一次。

2、貼壁細胞需用0.25％胰酶常規(guī)消化將細胞消化下來，將細胞懸液收集至離心管中。
3、1000rpm離心5分鐘，棄上清液。
4、沉淀加含DMSO的培養(yǎng)液，計數(shù)，調(diào)整至（1-10）×106/ml。

5、將懸液分至凍存管中，每管1ml。

6、密封凍存管，封口一定要嚴，否則復蘇時易出現(xiàn)爆裂。
7、用記號筆標明細胞種類，凍存日期。

8、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘〕→冰箱冷凍室（30分鐘）→超低溫冰箱（—80℃過夜）→液氮。

原代細胞復蘇技術(shù)

1、取出細胞，迅速放入37℃溫水中快速解凍。
2、吸出細胞懸液，并加10倍以上培養(yǎng)液。
3、1000r/分鐘離心5分鐘，去除上清。
4、用培養(yǎng)液適當稀釋后接種培養(yǎng)瓶，放入37℃ CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
鏡檢細胞貼壁能力。次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

原代細胞染色技術(shù)

一．臺盼藍染色
1、制備單個細胞懸液，并作適當稀釋（106細胞/ml)。
2、染色：取9滴細胞懸液移入小試管中，加一滴0.4%臺盼藍溶液，混勻。
3、計數(shù)：在3分鐘內(nèi)，用血球計數(shù)板分別計數(shù)活細胞和死細胞。
4、鏡下觀察，死細胞被染成藍色，而活細胞拒染。
5、按公式計算細胞活力。 
 
二．伊紅Y染色
1、制備1×106-5×106細胞／ml的細胞懸液。
2、取0.1ml細胞懸液加0.1ml伊紅Y染液混合。
3、用計數(shù)板鏡下計數(shù)活、死細胞數(shù)。
4、鏡下觀察，著紅色的為死細胞。按公式計算細胞活力。
 
三．苯胺黑染色實驗
1、制備1×106-5×106細胞／ml的細胞懸液。
2、將1份1%苯胺黑溶液與含血清生理鹽水作1：9混合稀釋，使其成0.1%苯胺黑染液。
3、取0.1ml細胞懸液加0.1ml苯胺黑染液混合。室溫放置10分鐘。
4、用計數(shù)板鏡下計數(shù) ，黑色細胞為死細胞，按公式計算活細胞率。 
  
原代細胞計數(shù)技術(shù)

1、準備計數(shù)板：用酒精清潔計數(shù)板及專用蓋玻片，然后輕輕拭干。
2、制備細胞懸液：用消化液分散單層培養(yǎng)細胞或直接收集懸浮培養(yǎng)細胞，制成單個細胞懸液。要求細胞密度不低于104/ml，若細胞數(shù)很少，應將懸液離心（1000rpm，2分鐘），重懸浮于少量培養(yǎng)液中。
3、加樣：用習慣輕吹打細胞懸液，取少許細胞懸液，在計數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)加微量細胞懸液。
4、計數(shù)：計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算：細胞數(shù)/ml＝4大格細胞總數(shù)/ 4×10000。