熒光顯微鏡技術(shù)原理和方法

　　1)訓(xùn)練目的：學(xué)習(xí)熒光顯微鏡的使用；了解熒光顯微鏡技術(shù)原理和方法。

　　2)實(shí)驗(yàn)材料 リンク： http://web.sgihara.comUGG 通販 モンクレール レディース ニューバランス 激安 ：生物素標(biāo)記的dUTP(Biotin-dUTP)或地高辛標(biāo)記的duUTP(Digoxingening-11-dullP)1 nmol／μL,TdT酶(25U／μL)，反應(yīng)緩沖液，洗滌緩沖液，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的親合素或鏈霉親合素(2.5μg/mL)或抗地高辛抗體(1：30)，PI染液(含PI 5μg/mL)，PBS緩沖液，蓋玻片，培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞，懸浮細(xì)胞的甩片或涂片，冰凍切片，常規(guī)石蠟切片。

　　3)操作步驟
　　①固定：培養(yǎng)細(xì)胞的制片或冰凍切片用4％多聚甲醛固定30min(4℃冰箱)后，用80％酒精再固定2h(20℃冰箱)；常規(guī)4％中性福爾馬林固定、石蠟切片進(jìn)行脫蠟、水合。
　　②洗滌：將玻片浸入PBS緩沖液，搖床上洗滌5min，洗3次。
　　③反應(yīng)：洗滌后的玻片用吸水紙吸干細(xì)胞或組織周圍水分，按50μL／cm2滴加反應(yīng)液(每50μL反應(yīng)液含TdT酶0.5μL，標(biāo)記的dUTP 1μL)，使反應(yīng)液均勻地覆蓋于所有細(xì)胞或組織切片上，蓋上塑料蓋玻片，置濕盒中，37℃孵育1h。
　　④終止反應(yīng)：去掉塑料蓋玻片，將玻片置于盛有洗滌緩沖液的染色缸內(nèi)，洗滌2次，每次5min。
　　⑤FITC標(biāo)記：洗滌后的玻片用吸水紙吸去細(xì)胞或組織周圍水分，按50μL／cm2滴加FITC反應(yīng)液(含FlTC 2.5μg/mL)，室溫下避光孵育10min。
　　⑥洗滌：將玻片置于洗滌緩沖液內(nèi)，洗2次，每次5min。
　　⑦PI復(fù)染：將玻片置于盛有Pl染液的染色缸內(nèi)，室溫下避光染色30min。
　　⑧封片：用蓋玻片直接蓋在含PJ染液的玻片上，也可用無色指甲油涂于蓋玻片四周邊緣，置暗盒中，鏡檢觀察。

　　4)結(jié)果判斷：用熒光顯微鏡觀察，選用藍(lán)色激發(fā)光(波長488nm)，所有的細(xì)胞核均被PI著色，顯示出紅色熒光，而凋亡細(xì)胞被特異地標(biāo)記上FITC，顯示出黃綠色熒光。