融合蛋白的免疫篩選實驗

實驗材料    大腸桿菌 
試劑、試劑盒    LB頂層瓊脂糖疊氮鈉第一抗體 
儀器、耗材    硝酸纖維素濾膜 
抗體    CD2抗體 
山羊Lambda Light Chain多克隆抗體 
山羊Complement C4多克隆抗體 

實驗步驟：     
1. 在150 ml LB平板上滴定λgt11 cDNA文庫的滴度，宿主菌為大腸桿菌LE392菌株，每個平板使用7 ml 1%LB頂層瓊脂。 
2. 選擇適當?shù)牡味蠕伷桨澹��?/FONT>37℃溫育8h。 
3. 將直徑132 mm硝酸纖維素濾膜分別編號，放入上述已培養(yǎng)8 h的平板中，于37℃溫育。 
4. 用針頭刺孔并用印度墨汁在每張濾膜上作一標記，然后取出濾膜。 
5. 在室溫用免疫篩選緩沖液洗膜30 min，以封閉濾膜并洗去膜上的殘留細菌，重復洗滌2~4次。 
6. 將第一抗體（稀釋于免疫篩選緩沖液中，終濃度為0.5~10 μg/ml）加到裝有濾膜的塑料袋中，熱封口后置40℃水平搖床上反應2~24h。 
7.  于4℃用免疫篩選緩沖液洗膜4~5次，毎次5~10min。 
8.  接著將125I 標記的第二抗體（0.5×106cpm/ml）加入裝有濾膜的熱封塑料袋中，4℃反應2~6 h。 
9.  在4℃用免疫篩選緩沖液洗膜4~5次，然后用濾紙將濾膜上的液體吸干。 
10.  用塑料保鮮膜包裹好濾膜，使用增感屏在-70℃對X光片曝光。 
11.  通過反復稀釋，純化λ噬菌體cDNA融合蛋白克隆，最終獲得單一的陽性克隆。 
12.  培養(yǎng)陽性克隆，制備重組λ噬菌體DNA。