柱離心法純化質(zhì)粒DNA

實驗原理：
1.離心柱結(jié)構(gòu)：特殊硅基質(zhì)吸附材料，特異性吸附DNA，而RNA與蛋白質(zhì)穿過。在正常情況下，核酸表面覆蓋了一層由水分子組成的親水薄膜，以維持其水溶性。高濃度鹽離子的加入破壞了核酸表面親水薄膜的相對有序排列，形成了疏水環(huán)境。在此環(huán)境中，核酸與硅膠膜能有效結(jié)合，而蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物和其他污染物則不能結(jié)合。
2.堿變性抽提的原理是在pH高于12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，破壞了堿基配對，導(dǎo)致雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，但閉環(huán)的質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開。當(dāng)pH調(diào)至中性時，質(zhì)粒DNA鏈迅速恢復(fù)到原來構(gòu)型，仍保存于溶液中。而變性的染色體DNA不能再復(fù)性，通過離心，隨不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來，使兩者得以分離。

實驗試劑：
1.試劑盒自帶溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
2.漂洗液
3.結(jié)合緩沖液
4.洗脫緩沖液
5.TE buffer

實驗設(shè)備：
1. 吸附柱
2. 取液槍
3. 離心機(jī)
4. 低壓電泳儀
5. 水平電泳槽
6. 紫外透射儀

實驗材料：帶有質(zhì)粒的大腸桿菌

實驗步驟：
1.培養(yǎng)細(xì)菌：將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種到1.5~3ml含有相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12～16小時；
2.取液體培養(yǎng)液3ml(1.5mlX2)于離心管中，10000r/min離心1min，去掉上清液，加入100ml 溶液I，充分混勻；置冰上；
3.加入150ml溶液II，加蓋顛倒6~7次使之混勻，冰上放置1~2min；
4.加入150ml溶液III，加蓋后顛倒6~7次混勻，冰上放置5min；
5.用臺式高速離心機(jī)，12000r/min離心10min；
6.吸附柱中加入420ul結(jié)合緩沖液，將步驟5中的上清轉(zhuǎn)移至吸附柱中，蓋上收集管的蓋子，混勻，12000r/min離心1min；
7.取下吸附柱，倒掉收集管中的液體，吸附柱放回同一收集管，向吸附柱中加入600ul漂洗液，靜置1min，12000r/min離心30s；
8.重復(fù)步驟7一次；
9.取下吸附柱，倒掉收集管中的液體，吸附柱放回同一收集管，12000r/min離心2min；
10.吸附柱放入一個新的1.5ml離心管，在吸附柱的中央加40ul洗脫緩沖液或TE buffer，室溫放置3~5分鐘。蓋好蓋子12000rpm離心1分鐘，收集質(zhì)粒DNA溶液。
11.取5ul電泳檢查，（100ml凝膠加入5ul染料）。

注意事項：加樣時要排出槍頭中的空氣，以免攪動液面。