Southern轉(zhuǎn)印分析方法步驟

在膠體中的DNA可利用毛細(xì)現(xiàn)象的作用將DNA牽引轉(zhuǎn)印至覆蓋在膠片上的濾膜，經(jīng)烘烤或UV照射后，可使DNA固定在膜上，以進(jìn)行探針的雜合（hybridization）反應(yīng)。

儀器用具：
玻璃缸；玻璃板或吸水海綿；Crosslinker

藥品試劑：
10×SSC（1.5MNaCl；0.15Msodium citrate）或20×SSC
變性溶液（1.5M NaCl；0.5 NNaOH）
中和溶液（1MTris-Cl；1.5 M NaCl，pH7.5）
Nylon membrane尼龍膜
40 Methods in Biotechnology Vol 1
Whatman 3MM濾紙
吸水紙

方法步驟：
1）電泳的洋菜膠片，浸于0.25NHCl中15min（當(dāng)DNA分子量不大時，可省去此步驟）；以無菌水潤洗膠片后，將膠片置于變性溶液中，于室溫緩慢震蕩15min，更換新的變性溶液后再處理15min.
2）以無菌水潤洗膠片，再以中和溶液浸泡30min，其間更換一次。
3）戴手套將尼龍膜剪裁成膠體大小，在角落剪一缺口作記號。另裁剪數(shù)張較膠片稍小的3MM 濾紙。
4）取一玻璃缸，加入10×SSC。將一塊長形玻璃板架在缸上，裁剪一張長形3MM濾紙，寬度須略大于膠片，將濾紙置于玻璃板上，使濾紙兩端順著玻璃板垂入缸內(nèi)溶液中。加一些10×SSC于濾紙上使其濕透，并趕掉濾紙與玻璃板間的氣泡。
若有3~5cm厚的干凈海綿，則可取代玻璃板。可將海綿置于缸中，加入10×SSC，但不可淹過海綿。海綿濕透后，其上放一張比膠片大的3MM濾紙，要趕掉濾紙與海綿間的氣泡。
5）將處理過的膠片置于濾紙上，趕掉氣泡，小心將尼龍膜蓋在膠片上，不要有氣泡產(chǎn)生。 再依序蓋上兩張以10×SSC浸濕的濾紙及兩張干的濾紙，并以保鮮膜將膠片四周封住。最后覆蓋一迭吸水紙，上面放一塊玻璃板或塑料板，以重物壓住即可。在室溫下靜置過個夜。
6）轉(zhuǎn)印后，小心移去重物、吸水紙、3MM 濾紙等，在尼龍膜相對于樣品槽的位置作記號。將尼龍膜掀開，與膠片接觸面朝上，置于10×SSC中緩慢震蕩5min，以洗去附著在膜上的洋菜膠。轉(zhuǎn)印后的膠片可再以EtBr染色，視是否轉(zhuǎn)印完全。
7）將尼龍膜置于干凈的濾紙上（與膠片接觸面朝上），移至UVcrosslinker中，進(jìn)行crosslinking 以將DNA固定在膜上。
8）干燥后的尼龍膜即可進(jìn)行雜合。若不立即進(jìn)行雜合，可將尼龍膜夾于兩張濾紙間，置于干燥箱中存放。