PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定與純化實(shí)驗(yàn)原理及實(shí)驗(yàn)過(guò)程

實(shí)驗(yàn)原理

瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。（原理參照瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA實(shí)驗(yàn)）

本實(shí)驗(yàn)使用了TaKaRa公司的膠純化試劑盒（Agarose Gel DNA Purification Kit），該試劑盒是從瓊脂糖凝膠中回收并純化DNA片段的試劑盒。試劑盒采用了獨(dú)特的凝膠融解系統(tǒng)，結(jié)合DNA制備膜技術(shù)，具有高效、快速、方便的特點(diǎn)，全套操作只需30min便可完成。使用該試劑盒每次可純化得到多至10µg的DNA片段（100bp～30kb），回收率高達(dá)50～80%。本試劑盒回收純化的DNA片段純度高，完整性好，可直接用于連接反應(yīng)、PCR擴(kuò)增、DNA測(cè)序等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

經(jīng)膠純化試劑盒回收的DNA片段采用-20℃低溫保存，延緩DNA的降解。

實(shí)驗(yàn)試劑

1. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2. Agarose Gel DNA Purification Kit (TaKaRa)

3. 瓊脂糖

4. 1×TAE

5. 6×Loading Buffer

6. DNA Marker 2000

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

1. 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)

2. 紫外透射儀

3. 臺(tái)式離心機(jī)

4. 移液槍?zhuān)ㄅ涮讟岊^）

5. -20℃低溫冰箱

6. 分析天平

實(shí)驗(yàn)材料

1. 單面刀片

2. 純化試劑盒

3. 1.5mL離心管

4. 超純水（無(wú)菌）

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 使用1×TAE緩沖液制作瓊脂糖凝膠，然后對(duì)目的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。（參照瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA實(shí)驗(yàn)）

2. 在紫外燈下切出含有目的DNA（約600bp）的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。此時(shí)應(yīng)注意盡量切除不含目的DNA部分的凝膠，盡量減小凝膠體積，提高DNA回收率。

     注意：切膠時(shí)請(qǐng)注意不要將DNA長(zhǎng)時(shí)間暴露于紫外燈下，以防止DNA損傷。

3. 切碎膠塊。膠塊切碎后可以加快操作步驟6的膠塊融化時(shí)間，提高DNA的回收率。

4. 稱(chēng)量膠塊重量，計(jì)算膠塊體積。計(jì)算膠塊體積時(shí)，以1mg=1µL進(jìn)行計(jì)算。

5. 向膠塊中加入膠塊融化液DR-I Buffer，DR-I Buffer的加量如下表：

凝膠濃度     DR-I Buffer 使用量  

1%                 3個(gè)凝膠體積量 

1%-1.5%       4個(gè)凝膠體積量 

1.5%-2%       5個(gè)凝膠體積量

6. 均勻混合后75℃加熱，融化膠塊（低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠只需在45℃加熱）。此時(shí)應(yīng)間斷振蕩混合，使膠塊充分融化（約6～10分鐘）。

注意：膠塊一定要充分融化，否則將會(huì)嚴(yán)重影響DNA的回收率。

7. 向上述膠塊融化液中加入DR-I Buffer量的1/2體積量的DR-II Buffer，均勻混合。當(dāng)分離小于400 bp的DNA片段時(shí)，應(yīng)在此溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。

8. 將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

9. 將上述操作7的溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12000 rpm離心1min，棄濾液。

注意：如將濾液再加入Spin Column中離心一次，可以提高DNA的回收率。

10. 將500 µL的Rinse A加入Spin Column中，12000 rpm離心30s，棄濾液。

11. 將700 µL的Rinse B加入Spin Column中，12000 rpm離心30s，棄濾液。

12. 重復(fù)操作步驟11。

13. 將Spin Column安置于新的1.5 mL的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入25 µL的滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置1min。

注意：使用加熱至60℃的滅菌蒸餾水或Elution Buffer有利于提高洗脫效率。

14. 12000 rpm離心1min洗脫DNA。

-20℃低溫保存純化的目的DNA片段。