如何解決色譜柱使用過程中出現(xiàn)的問題

　　一、保留值與分離度重現(xiàn)性不好原因分析

問題	原因	表現(xiàn)
不同色譜柱間差異使用期間柱變化	填料、鍵合相不同 柱床破壞 鍵合相丟失 硅膠基質(zhì)溶解 強保留組分堆積堵塞	保留因子(k), 分離因子(a） 柱效(N） 保留因子(k), 分離因子(a） 柱效(N) 保留因子(k), 柱效(N)
柱外效應(yīng)	系統(tǒng)差異、進(jìn)樣量大、進(jìn)樣閥與色譜柱之間、色譜柱與檢測器之間的管路太長、檢測器流通池體積大、接頭死體積大等。	柱效(N)
分離效果變差	流動相組分改變 流速改變 溫度改變	保留因子(k)，柱效變化很小 保留因子(k), 分離因子(a) 保留因子(k), 柱效變化很小
柱平衡慢	重新平衡時間不夠	保留因子(k), 柱效變化很小
柱超載	樣品量太大	保留因子(k), 柱效(N)

　　二、造成色譜峰( 不對稱)拖尾的原因

　　1.色譜柱本身填裝問題,篩板堵塞或填料塌陷;

　　2.柱頭有污染;

　　3.樣品超載;

　　4.樣品溶劑不合適;

　　5.柱外效應(yīng);

　　6.化學(xué)或二次保留(硅羥基)效應(yīng);

　　7. 緩沖容量不足或不合適;

　　8. 重金屬污染。

　　三、如何解決峰形拖尾的問題

　　A. 與化學(xué)有關(guān)的拖尾問題

　　1.流動相中，加入30mM的三乙胺(用于堿性化合物)或醋酸胺(用于酸性化合物)， 未知化合物加醋酸三乙胺;

　　2.如仍然拖尾，將三乙胺換為二甲基辛胺(或醋酸二甲基辛胺);

　　3.降低進(jìn)樣量至<1μg。

　　B. 與色譜柱有關(guān)的拖尾問題

　　1.如柱頭處有強保留的樣品組分積聚，反相柱可用20倍柱體積的96%的二氯甲烷與4%甲醇，加1%氫氧化銨混合液沖洗;正向柱可用甲醇沖洗;

　　2.使用保護(hù)柱。

　　C. 與HPLC系統(tǒng)有關(guān)的峰拖尾和峰加寬

　　1.進(jìn)樣體積過大，(通�！�25μL);

　　2.進(jìn)樣閥與色譜柱及檢測器之間的管路體積過大(最佳連接管應(yīng)<20cm，內(nèi)徑為0.007");

　　3.檢測器流通池的體積過大。

　　四、如何貯存色譜柱

　　1.防止緩沖溶液和水溶液流動相產(chǎn)生微生物,做到流動相用多少配多少, 或在水流動相中加200ppm的疊氮鈉以抑制細(xì)菌生長(一定當(dāng)心其毒性和潛在的爆炸性);或在流動相中加20%的有機改性劑，也可抑制微生物生長， 有機改性劑還有助于流動相脫氣。

　　2.盡可能將色譜柱貯存于100%有機溶劑(乙晴最好)中，避免在緩沖溶液中保存。

　　3.使用緩沖溶液后的色譜柱，應(yīng)用15～20倍柱體積的不含緩沖劑的同種水-有機溶劑流動相沖洗色譜柱，后換成100%有機溶劑貯存。

　　4.避免用純水沖洗鍵合致密的C18柱。

　　5.將色譜柱的兩端用堵頭擰好，以免柱床填料干裂。