DNA片斷的回收

　　DNA片斷的回收

　　方法一：樹(shù)脂回收技術(shù)

　　本方法特別適合于PCR片段的回收，具有純度高、操作簡(jiǎn)潔等特點(diǎn)，經(jīng)此方法回收的片段可有效的用于重組載體構(gòu)建。通過(guò)15分鐘的純化過(guò)程,PCR產(chǎn)物即能被有效地從含引物二聚體、非特異性擴(kuò)增引物片斷等混合物中分離出來(lái)，成為高度無(wú)鹽的、不含其他大分子成分的純化片斷。在較寬的分子量范圍內(nèi)有較高的回收效率。下表為不同長(zhǎng)度的DNA片斷,在室溫條件下,用此純化系統(tǒng)直接純化時(shí),各自相應(yīng)的回收率。

　　dsDNA長(zhǎng)度bp 200 1500 300 200 75 50

　　回收率% ≥ 60 96 99 69 3 2

　　一：儀器 離心機(jī)電泳議電泳槽取液器微量真空裝置抽濾裝置

　　二：PCR片斷純化試劑盒80%異丙醇

　　三：操作

　　(一)從瓊脂糖介質(zhì)中純化DNA片斷

　　1:用低熔點(diǎn)或常規(guī)熔點(diǎn)瓊脂糖電泳對(duì)PCR擴(kuò)增片斷進(jìn)行分離,該電泳安常規(guī)方法進(jìn)行,緩沖液為T(mén)AE.

　　2:在凝膠上,找到所需條帶,然后用潔凈并滅菌的小刀將其切下接近300微升瓊脂糖凝膠 (約300毫克)

　　3:如果切下的瓊脂糖為高融點(diǎn)的則安下面A步驟進(jìn)行,如為低融點(diǎn)瓊脂,則安B步驟進(jìn)行。

　　A：將300微升瓊脂塊放進(jìn)1.5毫升的微量離心管中,加入1毫升純化用樹(shù)脂,然后將其置于65℃水浴保溫5分鐘,或保溫至瓊脂完全溶解。

　　B： 將300微升瓊脂塊放進(jìn)1.5毫升的微量離心管中,然后將其置于70℃水浴保溫至瓊脂完全溶解,然后加入1毫升純化用樹(shù)脂到融化好的瓊脂中,將其混合20秒,但不要振動(dòng)。

　　4:為每一個(gè)待回收片斷準(zhǔn)備好一個(gè)微量柱. 在每個(gè)柱的開(kāi)口處,聯(lián)上一針筒,然后將這些柱與針筒的復(fù)合體與抽真空設(shè)備相連

　　5:在柱-針筒復(fù)合體中加入樹(shù)脂/DNA混合物,打開(kāi)真空裝置,將樹(shù)脂與DNA的混合物抽到 微量柱中,斷開(kāi)真空裝置與柱的連接。

　　6:洗柱,加入2毫升80%的異丙醇,打開(kāi)真空裝置,使這些洗柱液完全流經(jīng)微量柱。

　　7:繼續(xù)真空30秒以干燥樹(shù)脂,注意此干燥時(shí)間不能超過(guò)30秒。關(guān)閉真空,移去針筒。將微量柱轉(zhuǎn)移至一1.5毫升微量離心管中。10000g離心2分鐘,以徹底除去殘存的異丙醇。

　　8: 將微量柱,再轉(zhuǎn)移至一新的1.5毫升微量離心管中,加入50微升水或TE緩沖液,靜置1分鐘(在頭30秒,DNA仍將吸附于柱上), 10000g離心20秒,以洗脫DNA片斷，所得純化后的DNA片斷可直接用于連接反應(yīng)或在-20℃保存。

　　注：1對(duì)于>3Kb的片斷在純化回收時(shí),洗脫前,如先將水或TE緩沖液預(yù)熱到65-80℃,則將能有效的提高回收率。待洗脫片斷>3Kb時(shí),洗脫液溫度應(yīng)為65-80℃;待洗脫片斷>20Kb時(shí),洗脫液溫度應(yīng)達(dá)80℃。

　　2應(yīng)用TAE緩沖液，而不應(yīng)用含TBE的膠，因硼酸能與瓊脂糖中的方式糖單體或多聚體結(jié)合成難溶復(fù)合物，這種復(fù)合物使膠難熔解。

　　3：在取用純化柱樹(shù)脂中的液體前,應(yīng)將樹(shù)脂充分?jǐn)噭?如樹(shù)脂中出現(xiàn)結(jié)晶或結(jié)塊,則應(yīng)將樹(shù)脂在25-37℃,溫?zé)?0分鐘,冷卻至30℃使用。樹(shù)脂本身不會(huì)溶。

　　4：在紫外光下觀(guān)察切割條帶時(shí),操作要快，DNA條帶在紫外光下的暴露時(shí)間應(yīng)盡量短，因UV會(huì)引起DNA變異。